Biochemická a molekulárno-genetická analýza mitochondriálneho HMG-box obsahujúceho proteínu Gcf1 kvasinky Candida albicans
Visacka K
PhD Dissertation (2010): 135.
Category: Candida, mitochondrial nucleoids ¤ Added: Nov 15, 2012 ¤ Rating: ◊◊
Molekuly mitochondriálnej DNA (mtDNA) sú zbaľované do DNA-proteínových štruktúr nazývaných mitochondriálne nukleoidy (mt-nukleoidy). Hlavným proteínom zohrávajúcim úlohu v zbaľovaní mtDNA kvasinky Saccharomyces cerevisiae do mt-nukleoidov je proteín Abf2, obsahujúci dve HMG-box domény (high mobility group domain) zodpovedné za nešpecifickú väzbu na DNA. Komparatívnou analýzou genómov viacerých druhov kvasiniek bola odhalená prítomnosť niekoľkých HMG-box obsahujúcich proteínov, následne klasifikovaných do troch tried. Jedným z týchto proteínov je mitochondriálny proteín CaGcf1 kvasinky Candida albicans. Pomocou in silico analýzy bola v štruktúre CaGcf1p predikovaná minimálne jedna HMG-box doména a jedna coiled-coil doména. Udržiavanie mtDNA C. albicans je esenciálne pre prežitie buniek, preto popísanie molekulárnych mechanizmov zodpovedajúcich za udržiavanie mt-nukleoidov je dôležité pre porozumenie regulácie dynamiky mtDNA. Hlavným cieľom predkladanej dizertačnej práce bola charakterizácia vlastností proteínu CaGcf1. Lokalizačnými štúdiami bolo zistené, že CaGcf1p sa nachádza v mitochondriách C. albicans. CaGCF1 bol exprimovaný v Escherichia coli a proteín bol purifikovaný afinitnou chromatografiou. Schopnosť CaGcf1p viazať DNA bola odhalená technikou EMSA (electrophoretic mobility shift assay) využitím štiepenej mtDNA C. albicans ako substrátu. Ultracentrifugáciou v glycerolovom gradiente bolo zistené, že CaGcf1p sa v roztoku nachádza v monomérnom stave. S cieľom sledovať vplyv absencie CaGcf1p na fenotyp buniek bol pripravený mutantný kmeň C. albicans, v ktorom jedna alela génu CaGCF1 bola deletovaná a druhá bola umiestnená pod kontrolu regulovateľného MET3 promótora. Mutantný kmeň vykazoval pomalšiu rýchlosť rastu v porovnaní so štandardným kmeňom, čo bolo pravdepodobne spôsobené v dôsledku zníženým počtom kópií mtDNA.
Keywords: mitochondriálne nukleoidy, DNA viažuci proteín, zbaľovanie mtDNA, CaGcf1p, Candida albicans